RNA-seq入門RNA-seq実験では何を測定しているのか？実験設計における重要な考慮事項RNA-seqデータの定量化：リードからカウント行列への変換プロセス参照配列を見つけるには本ワークショップではどのような方向性を目指していくのでしょうか？
- RNA-seqは、特定の時点における細胞または組織内で発現しているRNA分子の量を測定する技術です。
- RNA-seq実験を計画する際には、多くの重要な選択事項があります。例えば、ポリA選択法を採用するかリボソーム除去法を適用するか、ストランド特異的プロトコルを使用するか非ストランド特異的プロトコルを採用するか、リードをシングルエンドで配列決定するかペアエンドで配列決定するかなどです。これらの選択はいずれも、データ処理および解釈に重大な影響を及ぼします。
- RNA-seqデータの定量化には複数の手法が存在します。代表的な方法としては、リードをゲノム配列にアラインメントし、遺伝子領域にオーバーラップするリード数をカウントする手法があります。また、別の手法ではリードをトランスクリプトームにマッピングし、確率的アプローチを用いて各遺伝子または転写産物の存在量を推定します。
- アノテーション済み遺伝子に関する情報は、Ensembl、UCSC、GENCODEなどの複数の情報源から取得可能です。
RStudioプロジェクトと実験データ
- プロジェクトに必要なファイルを作業ディレクトリに適切に整理することは、秩序を維持し、将来のアクセスを容易にするために重要です。
- RStudioプロジェクトは、プロジェクトの作業ディレクトリを管理し、分析を促進するための貴重なツールとして機能します。
- Rにおける
download.file関数は、インターネットからデータセットをダウンロードするために使用できます。
Rに量的データをインポートしてアノテーションを付ける
- 使用される遺伝子発現定量ツールによって、出力を
SummarizedExperimentまたはDGEListオブジェクトに読み込む方法が異なります（多くはBioconductorパッケージで配布されています）。 - EnsemblやEntrez IDなどの安定した遺伝子識別子は、RNA-seq分析全体で主要な識別子として使用されるべきで、解釈を容易にするために遺伝子シンボルを追加する必要があります。
探索的解析と品質管理
- 探索的分析は、データセットの品質管理と潜在的な問題の検出において不可欠なプロセスです。
- 探索的分析手法には様々な種類があり、それぞれ異なる前処理済みデータを必要とします。最も一般的に用いられる手法では、カウント値の正規化と対数変換（あるいは同等のより感度の高い/高度な処理）が行われ、データの均方分散性に近い状態が求められます。一方、他の手法では生のカウント値をそのまま処理対象とします。
Differential expression 解析
- DESeq2では、差異的発現解析の主要な手順（サイズ因子推定、分散推定、検定統計量の算出）が単一の関数DESeq()に統合されています。
- 発現量の低い遺伝子を独立してフィルタリングすることは、多くの場合有効な手法です。
design matricesの詳細な解析
- R言語のformulaフレームワークを使用すると、設計行列を作成できます。この設計行列は、遺伝子発現レベルにおける系統的な差異に関連すると予想される変数の詳細を記述するものです。
- 比較対象として関心のある条件は、モデル係数の線形結合であるコントラストを用いて定義することができます。
遺伝子セットエンリッチメント解析
- ORA解析は遺伝子カウントデータに基づいており、Fisherの正確確率検定または超幾何分布を用いて統計的有意性を評価します。
- R環境では、多様なソースから容易に遺伝子セットを取得することが可能です。
Next steps
- RNA-seq data is very versatile and can be used for a number of different purposes. It is important, however, to carefully plan one’s analyses, to make sure that enough data is available and that abundances for appropriate features (e.g., genes, transcripts, or exons) are quantified.