RNA-seq入門RNA-seq実験では何を測定するのか？実験デザインの考察RNA-seq定量化：リードからカウントマトリックスまで参照配列の検索このワークショップで我々はどこに向かっているのか？
- RNA-seqは、ある細胞／組織内で発現しているRNAの量と、ある時点での状態を測定する技術である。
- RNA-seq実験を計画する際には、ポリA選択とリボソーム除去のどちらを行うか、ストランドプロトコルとアンストランドプロトコルのどちらを適用するか、シングルエンドとペアエンドのどちらでリードをシーケンスするかなど、多くの選択をしなければならない。 それぞれの選択は、データの処理と解釈に結果をもたらす。
- RNA-seqデータの定量化には多くのアプローチが存在する。 リードをゲノムにアライメントし、遺伝子座にオーバーラップするリードの数をカウントする方法もある。 他の方法は、リードをトランスクリプトームにマッピングし、確率的アプローチを使って各遺伝子や転写産物の存在量を推定する。
- 注釈付き遺伝子に関する情報は、Ensembl、UCSC、GENCODEなどいくつかの情報源からアクセスできる。
RStudioプロジェクトと実験データ
- プロジェクトに必要なファイルを作業ディレクトリに適切に整理することは、秩序を維持し、将来のアクセスを容易にするために重要です。
- RStudioプロジェクトは、プロジェクトの作業ディレクトリを管理し、分析を促進するための貴重なツールとして機能します。
- Rにおける
download.file関数は、インターネットからデータセットをダウンロードするために使用できます。
Rに量的データをインポートして注釈を付ける
Exploratory analysis and quality control
- Exploratory analysis is essential for quality control and to detect potential problems with a data set.
- Different classes of exploratory analysis methods expect differently preprocessed data. The most commonly used methods expect counts to be normalized and log-transformed (or similar- more sensitive/sophisticated), to be closer to homoskedastic. Other methods work directly on the raw counts.
Differential expression analysis
- With DESeq2, the main steps of a differential expression analysis (size factor estimation, dispersion estimation, calculation of test statistics) are wrapped in a single function: DESeq().
- Independent filtering of lowly expressed genes is often beneficial.
Extra exploration of design matrices
- The formula framework in R allows creation of design matrices, which details the variables expected to be associated with systematic differences in gene expression levels.
- Comparisons of interest can be defined using contrasts, which are linear combinations of the model coefficients.
Gene set enrichment analysis
- ORA analysis is based on the gene counts and it is based on Fisher’s exact test or the hypergeometric distribution.
- In R, it is easy to obtain gene sets from a large number of sources.
Next steps
- RNA-seq data is very versatile and can be used for a number of different purposes. It is important, however, to carefully plan one’s analyses, to make sure that enough data is available and that abundances for appropriate features (e.g., genes, transcripts, or exons) are quantified.